Ген антагониста рецептора интерлейкина 1 (IL1RN) играет важную роль в воспалительных реакциях зрелых миелоидных клеток. Ученые из Испании использовали CRISPR-систему для таргетного деметилирования и гиперметилирования промотора IL1RN. Это позволило запустить его «не вовремя», изменить судьбу иммунных клеток и повлиять на воспалительный ответ.
Credit:
123rf.com
ДНК-метилирование — ключевой эпигенетический механизм, регулирующий дифференцировку иммунных клеток. Однако установить причину конкретных эпигенетических изменений и их влияние на судьбу клетки сложно из-за ограничений традиционных методов (нокаут ферментов, гипометилирующие препараты), которые влияют на весь метилом. CRISPR-системы способны точечно изменять метилирование в заданных локусах, что позволяет решить эту проблему. Используя данную стратегию, ученые из Центра исследования лейкемии и Университета Барселоны (Испания) провели полногеномный анализ, чтобы установить взаимосвязь между метилированием ДНК в регуляторных областях и экспрессией генов в иммунных клетках, вследствие чего изменялась судьба миелоидных клеток и клеточная реакция на стимулы.
Сначала ученые пронализировали метилом лейкозных В-клеток (BlaER) и полученных из них индуцирванных неопухолевых макрофагов (iMac) с помощью полногеномного секвенирования с бисульфитной конверсией (WGBS), ATAC-seq и ChIP-seq.
При трансдифференцировке BlaER в iMac WGBS-анализ выявил масштабную реорганизацию паттернов метилирования ДНК. Так, спустя 96 часов индукции iMac было показано перераспределение 14% сигнала ДНКм. Перераспределение не было случайным. Некоторые регуляторные элементы претерпевают деметилирование, при этом происходит повышение доступности хроматина (по данным ATAC-seq).
Согласно данным RNA-seq, среди регуляторных элементов промотор IL1RN был идентифицирован как регион с наиболее выраженной обратной корреляцией между метилированием ДНК и экспрессией гена. Так, при переходе от BlaER к iMac терялось около 40% ДНКм, а уровень экспрессии гена возрастал в 1000 раз.
Таким образом, на стадии BlaER ген IL1RN, который играет важную роль в воспалительных реакциях зрелых миелоидных клеток, не экспрессируется, а его промотор полностью метилирован. Метилирование IL1RN снижается в период от 24 до 96 часов трансдифференцировки, что совпадает с реактивацией гена.
Чтобы поместить данные наблюдения за трансдифференцировкой в физиологический контекст, ученые также проанализировали наборы данных WGBS и RNA-seq от Blueprint Consortium, сосредоточившись на первичных В-клетках и макрофагах человека. Причем данные первичных клеток коррелировали с данными, полученными при трандифференцировке.
Далее ученые провели таргетное эпигенетическое редактирование промотора IL1RN. Благодаря деметилированию ДНК с помощью конструкции dCas9-TET1 экспрессия гена IL1RN активировалась в BlaER (более чем 15-кратное увеличение уровня мРНК и более чем 60-кратное увеличение уровня белка). Редактирование с помощью dCas9-TET1 активировало экспрессию специфического для миелоидных клеток гена в «неподходящих» клетках, тем самым показав причинно-следственную связь между статусом метилирования ДНК в промоторе IL1RN и экспрессией гена.
Гиперметилирование промотора IL1RN с помощью dCas9-DNMT3A приводило к нарушению дифференцировки миелоидных клеток человека и усилению способности к фагоцитозу.
Поскольку IL1RN действует как отрицательный регулятор сигнального пути IL-1, отредактированные iMac должны демонстрировать усиленный ответ на воспалительный стимул, опосредованный IL-1β, агонистом этого пути. Действительно, при стимуляции IL-1β iMac с отредактированным промотором IL1RN показали усиление активации NF-κB.: возросли ядерная локализация p65 и экспрессия 50 генов-мишеней p65 (включая NFKBIA, JUN). Одновременно с этим гены ISG15, OAS3 и USP18 экспрессировались слабее, что свидетельствует о подавлении интерферонового ответа.
Таким образом, единичного эпигенетического изменения — метилирования промотора IL1RN — достаточно для перепрограммирования клеточной судьбы и воспалительного ответа. Полученные результаты показывают, что такая эпигенетичекая терапия может способствовать точной настройке активности сигнального пути IL-1 при различных заболеваниях человека — от аутовоспалительных заболеваний до лейкемии или роста солидных опухолей.
Источник:
Gemma Valcárcel, et al. ,Modulating immune cell fate and inflammation through CRISPR-mediated DNA methylation editing. // Sci. Adv. 11, eadt1644(2025). Published online: 16 July 2025. DOI: 10.1126/sciadv.adt1644